2022年3月25日，由中国油画学会支持，奉贤博物馆主办，助艺文化、贝罗修复承办的“首届中国油画藏品现状与保护学术研讨会”于线上举办。

此次研讨会主要围绕“中国油画藏品现状与保护”主题，邀请国内公立和非公立收藏有油画作品的博物馆、美术馆，及其他收藏机构和收藏家、艺术家，从事油画保护和修复的专家等，就油画收藏现状与藏品的保护利用展开交流与研讨，226名业内人士和爱好者通过腾讯会议参会，另有近2万人次观看直播。

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3月25日 9：00-18：30

油画微生物病害的检测分析

• 文物有害生物 pest and pathogen of museum collection

• 有害生物病害 biological deterioration of museum collection

文物微生物病害，演讲PPT节选，作者提供

图1是一个曲霉的分生孢子头，当孢子从梗上脱落下来附着于表面之后，图8散落的孢子会分泌一些代谢产物，我们会发现表面有个深色的区域。这些产物可能是酶类，也可能是酸，也可能是脂等等，这些代谢产物可以降解表面的基质。

孢子菌丝，演讲PPT节选，作者提供，来源见参考文献

上图是孢子萌发出来的菌丝，有些可以穿过已经被降解的表面材料进入到内部成为假根。另外一些菌丝则能沿着表面平铺生长，成为匍匐菌丝。

图16，匍匐菌丝沿着玻璃纸生长，演讲PPT节选，作者提供，来源见参考文献

下图是我们自己拍的毛壳菌。透过透明的培养基，可以看到向下生长的假根和向上生长的旺盛的附属丝。油画的画布、画框或者颜料层，都可能是这个基质。一旦生长条件适宜，微生物的生长是极其迅速的，造成病害的爆发。

毛壳菌，演讲PPT节选，作者提供

油画颜料层裂隙中的霉菌，演讲PPT节选，作者提供

油画霉斑，演讲PPT节选，作者提供，来源见参考文献

这一幅表面则密布了白色的霉斑，肉眼直观可见的是变色，但肯定还伴随着画布内部的不可见的降解。

第二部分

油画微生物的检测分析技术

分析具体是哪些微生物造成了油画的病变，需要借助微生物病害的检测与分析方法。

这是最传统、最简单明了的实验，初中就做过用显微镜观察的实验，用棉拭子涂抹到培养基上培养再加上形态观察。想必大家做了这么多次核酸检测，对无菌棉拭子长什么样子已经不陌生了。这个研究就是用无菌棉拭子擦拭疑似油画表面有霉变的部位，然后进行培养，再利用光学设备观察微生物的形态，通过形态学特征来判断污染菌的种类。

从左至右：肉眼看到的菌落形态，光镜下的微生物形态，电镜下的微生物形态，来源见参考文献

真菌培养显微观察，演讲PPT节选，作者提供，来源见参考文献

以上图培养出来的真菌为例，常做镜检的人一看就知道，a是曲霉属，顶囊结果明显；b是青霉，有典型的帚枝状结构；c是枝孢菌属，以出芽生长方式形成长链；d是链格孢菌，属典型的棒状有隔膜孢子。这样，通过形态的观察判断污染菌的种类。

但是通常情况下，我们只能鉴定到属，比如，曲霉属、青霉属、脉胞菌属、链格孢属。但我们知道曲霉属有很多种曲霉，黑曲霉、黄曲霉、杂色曲霉、米曲霉、构巢曲霉等等，如果形态接近就无法继续判断，这是形态观察的一个缺点。

分子生物学的技术可以帮我们实现微生物的进一步鉴定。这是维也纳pinar团队的工作，这个团队专业从事油画的微生物病害分析、防治工作。

首先还是用棉拭子直接涂擦样品表面进行培养，然后为了了解一个群落而不是单一一株菌的情况，他们又做了4个生物膜样本。对培养样本，不再进行镜检观察，而是培养出了菌落就直接提取单菌落的DNA，再扩增这株菌的基因片段，然后通过随机扩增多态性的方法来鉴定这株菌是什么菌。

随机扩增多态性我们简称为RAPD，包括下面的变性凝胶梯度电泳DGGE技术，都可称之为微生物的分子指纹图谱技术。每个人有自己的指纹，每株菌也有自己独一无二的分子指纹。观察指纹有简单粗糙的办法，比如按个印泥就能看到。也有精细的方法，比如录手机指纹解锁的扫描方法。方法很多，但目的是一样的。

RAPD分析，演讲PPT节选，作者提供

这些电泳条带就是微生物的一种指纹图谱。通过RAPD分析，发现这幅油画表面有11株细菌，以芽孢杆菌为主，8株真菌，分别属于以下几个属。认真的读者就会发现，分离了11株菌，为什么电泳时只有10号菌株了呢？因为第3号泳道内的6B2和6B3两株菌的指纹图谱是一样的，所以鉴定为同一株菌，也就是说11株菌分别属于10个种。

2,3,4号的指纹图谱鉴定出来都是芽孢杆菌属，但对应到泳道里可以明显发现，它们的指纹是不一样的，所以它们不是同一株菌，指纹不同。同样真菌RAPD图谱，4和5的条带数与位置很像，鉴定出来都是青霉属青霉，但并不是同一株菌，因为4比5多了一条明显的白色条带。可能是双胞胎，但是不是同一株菌。这些细微的差异，形态检测是做不到的。

变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）很重要的一个优势是不需要培养，直接使用棉拭子涂抹就可以整体测试DNA，能够知道它们是什么。我们知道，自然界99%的微生物是不可以现有方式培养的，因此DGGE就突破了这个限制。

PCR-DGGE分析，演讲PPT节选，作者提供

从研究结果看，DGGE图谱上鉴定到的油画表面的微生物果真与培养获得的不一样，除了放线菌比较一致外，细菌和真菌种类都与可培养的不同，细菌是寡养单胞菌属为主，真菌则出现了念珠菌属和毕赤酵母属。那么，通过可培养和不可培养的方法互补，可使我们对油画表面微生物的了解更为全面。

特别问题一：

既然可以不用培养就鉴定出微生物，为什么还强调要获得油画表面可培养的微生物菌株？

因为我们要对这些菌进行一个“是否有害”的评估，并非所有微生物对文物都有害。

我们身体比如体表、消化道中有数以亿计的微生物，我们携带的微生物的重量总和约有2斤，那么多微生物也没有让我们生病。因为有些菌叫正常菌群，有利于维持我们人体的稳态，甚至我们还主动喝酸奶补充益生菌。有些叫条件致病菌，有些则是致病菌。对油画、对文物也是这样。因此只有拿到了分离培养的菌株，我们才能进一步做一些分析检测，比如做一些酶学的表征分析，判断它们对文物有没有伤害。

在Pinar研究获得的菌株中，细菌的代谢产物里有酯酶和酯酶脂肪酶，这些酶可能直接参与基质的降解，也就是油画基底材料的降解。真菌中也有酯酶和NAG的活性，NAG可以水解细菌细胞壁肽聚糖，这个真菌的危害就比较大。这可以解释为什么金属表面或者陶瓷器表面也会霉变，是因为NAG在酶的帮助下，真菌即便没有很好的有机养料，它还可以直接水解细菌的细胞壁进而加以利用。因此如果有灰尘，灰尘里面有细菌或放线菌的话，真菌就可以直接把细菌当成营养成分，继续生长。

因此也许有些油画表面的细菌不对油画造成直接的损伤，但是，它们的存在可以给霉菌的生长提供大量源源不断的、新鲜的营养成分供其生长。所以油画表面的细菌和放线菌检测也应该高度重视。

特别问题二：

油画上的微生物污染来源于哪里？

在Pinar的研究中，他们依然使用了前述的方法，培养+RAPD鉴定+DGGE的群落分析。同时，增加了这幅油画藏品展厅内空气微生物的检测分析。

可以看到，油画正面和背面的微生物采样得到了39株真菌，鉴定为青霉属、曲霉属、链格孢属和枝孢属、芽孢杆菌属等，是油画污染的老朋友。而空气样本中的微生物无论是真菌还是细菌，与从油画表面分离的微生物密切相关，说明油画表面的微生物污染可能的来源是空气中的孢子，其通过重力沉降在油画表面。

还有其他的一些油画微生物病害的检测方法，比如培养法+另一种指纹图谱技术T-RFLP。还有荧光染色法，用荧光染料与一小块油画残片孵育后进行直接的荧光激发观察。虽然直观，但因为是有损检测，我们并不推荐。

来源见参考文献

这是我们中心做的一批油画的微生物分析。这幅油画的正反两面都有霉变部位，我们采用培养法，标注好每个采样位置，然后用棉拭子对其进行擦拭，再涂布于培养基表面。接下来，把涂布了样品的培养皿放到培养箱中培养72小时，之后可以发现在采样位置上对应生长出一些真菌菌落，再对每一个菌落进行不断的分离纯化。

演讲PPT节选，作者提供

演讲PPT节选，作者提供

很多时候我们培养出来的样品可能是下图左上角这个样子的，密密麻麻互相污染，操作过程中可能一个轻微的抖动就会将旁边菌落的孢子带出来造成污染，所以要分离出每个单一的菌落过程十分漫长，工作量很大，每分离一次就是72小时，耗时耗力。

演讲PPT节选，作者提供

上图最右是我们在做这批油画分离的所有平板，最后得到了10个单菌落。提取各自的DNA进行ITS序列的扩增后直接测序，没有做指纹图谱，主要是考虑成本。分析结果表明，10株菌中有2株是同样的聚生小穴壳菌，3株毁丝霉属霉菌，3株枝孢属、1株节菱孢以及1株出芽短梗霉。

上述菌都具有高产纤维素酶的活性，可以降解纤维素，对油画存在伤害风险。有1株出芽短梗霉是产黑色素的，可能会对油画造成变色的污染。

另有聚生小穴壳菌，在与美国NIH的Genbank里的菌株序列进行比对后发现，这株聚生小穴壳的来源，有古柏树的内生真菌，有林业大学上传的资料，足以说明这株菌的危害对象最可能是木材，那么它的存在极有可能导致油画画框的腐朽。

北京林业大学在GenBank上传的序列信息，演讲PPT节选，作者提供

这幅油画上我们观察到了旺盛的微生物生长，但却没有分离到可培养的菌株，但这幅藏品很重要亟待进行保护怎么办？现在有Nanopore minion 纳米孔测序仪，只有掌上大小，实现对油画表面微生物的快速现场检测。Pinar团队用Minion 这个袖珍设备进行了两幅油画表面的微生物分析检测。从测序结果看，曲霉属占到了污染菌的30%以上。

Nanopore minion 设备，演讲PPT节选，作者提供

Nanopore minion 设备在南极现场进行过永冻土微生物的分析检测，也在NASA美国太空站内进行过太空中微生物的检测。我相信随着我国对文物微生物病害的重视程度不断加大，那么更多先进快捷的技术也将会在我国得以利用。

• 油画展览陈列及保存环境的控制：温度、相对湿度、环境微生物 

• 油画藏品的日常养护：定期巡检、文物本体的“洁净”、藏品保管人员规范化操作

一定要注意油画藏品的日常养护，经常巡检看有无病害发生，早发生早处理才不至于蔓延。霉菌的孢子一旦蔓延，速度很快，规模很大。藏品管理人员一定要注意自身的操作，接触文物时保证双手一定是干净的，进入库房穿好工作服和鞋套，最大限度避免自身携带。

• 油画藏品的消毒：入库前的检查与分级处理、绝氧/低氧处理、化学法消杀

当藏品出现了霉变，可分级处理，比较轻微的我们轻轻擦拭掉菌丝体即可，同时做好环境控制。中度的我们可以做物理处理，如低氧或绝氧消杀。如果大量藏品大面积出现霉变，那么该及时上化学熏蒸的也不要迟疑。

在净化空气中的微生物方面，我们重点科研基地自己研发了空气微生物净化装置，搭配自主研发的植物精油使用。通过平板计数验证效果，真菌显著减少。

www.3gmuseum.cn

馆藏文物有害生物控制研究国家文物局重点科研基地（重庆中国三峡博物馆）于2019年8月由国家文物局批准设立，是国家文物局第七批重点科研基地之一，也是我国西南地区唯一一家国家文物局重点科研基地。

如果遇到油画或其他文物霉变有需要咨询或者处理的，可以填写调查问卷，或通过电子邮箱：tanghuan3gm@163.com。谢谢。